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Western blot

内分泌

关键词内分泌 实验技术 免疫检测

词汇介绍

拓展阅读

解析

Western   英 /'west(ə)n/   美 /'wɛstɚn/

释    义   adj. 西方的,西部的;有西方特征的

               n. 西方人;西部片,西部小说

               n. (Western)人名;(英)韦斯顿

例    句   He will not be Eastern, he will not be Western, or he will be both together. 他不会是东方人,他不会是西方人,或者他将两者兼具。

 

blot   英 /blɒt/   美 /blɑt/

释    义   v. (用软纸或布)吸干;把墨水溅到(纸上);弄脏;玷污……的品性;(使)模糊,遮蔽;从记忆中抹去;(生化)印迹

               n. 污渍,墨渍,油漆斑;污点,耻辱;瑕疵,美中不足;(生化)印迹法

               n. (Blot) (法、德、美)布洛(人名)

例    句   Honestly face your inner conflicts and blot, do not deceive yourself. 诚实的面对你内心的矛盾和污点,不要欺骗你自己。

概述

概述


免疫印迹(有时称为蛋白免疫印迹)是一种在分子生物学领域广泛使用的分析技术,主要是免疫遗传学和其它分子生物学学科用来检测特定蛋白质组织匀浆或提取物。


应用


蛋白质印迹广泛用于生物化学中,用于定性检测单个蛋白质和蛋白质修饰(例如翻译后修饰)。它被用作鉴定复杂蛋白质混合物中特定单个蛋白质的存在的一般方法。蛋白质的半定量估计可以从印迹膜上蛋白质条带的大小和颜色强度得出。此外,可以使用稀释系列的已知浓度的纯化蛋白质来更精确地估计蛋白质浓度。蛋白质印迹通常用于克隆后蛋白质产生的验证。它还用于医学诊断,例如HIV测试或BSE-Test


验证性HIV测试使用蛋白质印迹来检测人血清样品中的抗HIV抗体。如上所述,分离来自已知HIV感染细胞的蛋白质并在膜上印迹。然后,将待测血清应用于一抗孵育步骤; 洗去游离抗体,并加入与酶信号连接的第二抗人抗体。然后染色的条带表示患者血清含有抗体的蛋白质。


蛋白质印迹也被用作变异克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)的确定性试验,克罗伊茨费尔特-雅各布病是一种与牛海绵状脑病(BSE,通常称为疯牛病)牛的受污染牛肉相关的朊病毒病。


某些形式的莱姆病检测采用蛋白质印迹法。Western blot也可用作乙型肝炎感染和HSV-22型疱疹)感染的确证试验。在兽医学中,有时使用蛋白质印迹来证实猫的FIV +状态。


蛋白质印迹技术的进一步应用包括世界反兴奋剂机构(WADA)的使用。血液兴奋剂是滥用某些技术和/或物质来增加一个人的红血球质量,这可以让身体向肌肉输送更多氧气,从而增加耐力和性能。有三种广泛已知的用于血液掺杂的物质或方法,即促红细胞生成素(EPO),合成氧载体和输血。根据世界反兴奋剂机构的禁用物质和方法清单,每一项都是禁止的。2014年国际足联世界杯期间,在该事件的反兴奋剂运动中使用了蛋白质印迹技术。总共收集了1000多个样本并由Reichel等人分析。在世界反兴奋剂机构认可的瑞士洛桑实验室。最近利用蛋白质印迹技术的研究表明,基于新型Velum SAR预制水平凝胶,优化常规分析,改善了血液和尿液中EPO的检测。随着水平SAR-PAGE与预制薄膜支持的Velum SAR凝胶相结合,rEPO的微剂量应用的辨别能力显着增强。


操作


蛋白质印迹法由凝胶电泳组成,通过3D结构分离天然蛋白质或通过多肽长度分离变性蛋白质,然后电泳转移到膜上(主要是PVDF膜或硝化纤维素膜)和免疫染色程序以显现印迹膜上的某些蛋白质。SDS-PAGE通常用于蛋白质的变性电泳分离。SDS通常用作缓冲液(以及凝胶中)以使所有蛋白质呈现均匀的负电荷,因为蛋白质可以带正电荷,负电荷或中性电荷。这种类型的电泳称SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。在电泳之前,蛋白质样品经常煮沸以使存在的蛋白质变性。这确保蛋白质基于大小分离并防止蛋白酶(分解蛋白质的酶)降解样品。另一种蛋白质分离方法是使用Hielscher Ultrasonics VialTweeter进行超声处理使用10个循环放置在4℃的冷室中,每个循环包括30秒超声处理100%振幅,然后30秒休息期。电泳分离后,将蛋白质转移到膜(通常是硝酸纤维素或PVDF),在那里用牛奶(或其他阻断剂)阻断它们以防止非特异性抗体结合,然后用特异于靶标的抗体染色蛋白。最后,膜将用识别第一抗体染色的第二抗体染色,然后可以通过多种方法用于检测。凝胶电泳步骤包括在蛋白质印迹分析中以解决抗体交叉反应性的问题。

Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques复制标题

蛋白质纯化和分析: 下一代Western blotting技术

发表时间:2017-11-04

影响指数:3.0

作者: Manish Mishra

期刊:Expert Rev Proteomics

The western blot is a common method used to detect proteins as well as posttranslational modifications on proteins, and can provide semi-quantitative or quantitative data about the target protein in simple or complex biological samples. Western blotting is an extensively used technique for protein analysis. It is a multistep procedure (Figure 1) that typically involves a) sample preparation (protein extraction and measurement of protein concentration) from cells or tissue lysates, b) separation of proteins by size on sodium dodecyl sulphate (SDS) polyacrylamide gel by electrophoresis, c) immobilization of separated proteins in a nitrocellulose or polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, d) blocking of non-specific proteins on membrane, e) probing of target proteins with specific primary antibodies, e) incubation with secondary antibody conjugated with labelled chemiluminescent or fluorescent molecule, f) detection of signal that reflects antigen/ antibody binding, g) densitometry analysis of protein bands of interest using a software. Variations at any step of the process can influence the result. Thus, care must be taken to standardize each step of the western blot process for reproducibility and high sensitivity.

译文

蛋白质印迹是用于检测蛋白质以及对蛋白质进行翻译后修饰的常用方法,并且可以提供关于简单或复杂生物样品中的靶蛋白质的半定量或定量数据。蛋白质印迹是一种广泛用于蛋白质分析的技术。这是一个多步骤程序(图1),通常涉及a)细胞或组织裂解液的样品制备(蛋白质提取和蛋白质浓度测量),b)通过电泳分离十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质, c)将分离的蛋白质固定在硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,d)阻断膜上的非特异性蛋白质,e)用特异性一抗探测靶蛋白质,e)与缀合有标记化学发光的二抗孵育或荧光分子,f)检测反映抗原/抗体结合的信号,g)使用软件对感兴趣的蛋白质条带进行光密度分析。过程中任何步骤的变化都会影响结果。因此,必须注意使蛋白质印迹过程的每个步骤标准化以获得再现性和高灵敏度。

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