CBC CFE CoSC Differentiation FACS Flow Cytometry Analysis GRP IEC IHC ISC PC Paneth cell Single-Cell Sorting Stemness colonic stem cell colony-forming efficiency crypt base columnar fluorescence-activated cell sorting green fluorescent protein immunohistochemistry intestinal epithelial cell intestinal stem cell qRT-PCR quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction
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摘要

BACKGROUND & AIMS:Identification of intestinal stem cells (ISCs) has relied heavily on the use of transgenic reporters in mice, but this approach is limited by mosaic expression patterns and difficult to directly apply to human tissues. We sought to identify reliable surface markers of ISCs and establish a robust functional assay to characterize ISCs from mouse and human tissues.
METHODS:We used immunohistochemistry, real-time reverse-transcription polymerase chain reaction, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) to analyze intestinal epithelial cells isolated from mouse and human intestinal tissues. We compared different combinations of surface markers among ISCs isolated based on expression of Lgr5-green fluorescent protein. We developed a culture protocol to facilitate the identification of functional ISCs from mice and then tested the assay with human intestinal crypts and putative ISCs.
RESULTS:CD44(+)CD24(lo)CD166(+) cells, isolated by FACS from mouse small intestine and colon, expressed high levels of stem cell-associated genes. Transit-amplifying cells and progenitor cells were then excluded based on expression of GRP78 or c-Kit. CD44(+)CD24(lo)CD166(+) GRP78(lo/-) putative stem cells from mouse small intestine included Lgr5-GFP(hi) and Lgr5-GFP(med/lo) cells. Incubation of these cells with the GSK inhibitor CHIR99021 and the E-cadherin stabilizer Thiazovivin resulted in colony formation by 25% to 30% of single-sorted ISCs.
CONCLUSIONS:We developed a culture protocol to identify putative ISCs from mouse and human tissues based on cell surface markers. CD44(+)CD24(lo)CD166(+), GRP78(lo/-), and c-Kit(-) facilitated identification of putative stem cells from the mouse small intestine and colon, respectively. CD44(+)CD24(-/lo)CD166(+) also identified putative human ISCs. These findings will facilitate functional studies of mouse and human ISCs.

译文

背景与目的: 肠道干细胞 (ISCs) 的鉴定在很大程度上依赖于在小鼠中使用转基因报告基因, 但是这种方法受到镶嵌表达模式的限制,难以直接应用于人体组织。我们试图鉴定 ISCs 可靠的表面标记,并建立一个强大的功能测定来表征来自小鼠和人体组织的 ISCs。
方法: 我们使用免疫组织化学、实时逆转录聚合酶链反应和荧光激活细胞分选 (FACS) 来分析从小鼠和人肠道组织中分离出来的肠上皮细胞。我们比较了基于 Lgr5-green 荧光蛋白表达分离的 ISCs 中表面标记的不同组合。我们开发了一种培养方案,以促进从小鼠中鉴定功能性 isc,然后用人类肠隐窝和假定的 isc 进行测试。
结果: 通过 FACS 从小鼠小肠和结肠中分离出的 CD44 () CD24 (lo) CD166 () 细胞表达了高水平的干细胞相关基因。然后根据 GRP78 或 c-Kit 的表达排除转运扩增细胞和祖细胞。来自小鼠小肠的 CD44 () CD24 (lo) CD166 () GRP78 (lo/-) 推定干细胞包括 Lgr5-GFP (hi) 和 Lgr5-GFP (med/lo) 细胞。这些细胞与 GSK 抑制剂 CHIR99021 和 E-cadherin 稳定剂 Thiazovivin 一起孵育导致集落形成 25% 至 30% 的单分类 isc。
结论: 我们开发了一种培养方案,基于细胞表面标记从小鼠和人体组织中鉴定假定的 ISCs。CD44 () CD24 (lo) CD166 () 、 GRP78 (lo/-) 和 c-Kit (-) 促进了来自小鼠小肠和结肠的假定干细胞的鉴定, 分别。CD44 () CD24 (-/lo) CD166 () 也鉴定了假定的人类 isc。这些发现将有助于小鼠和人类 ISCs 的功能研究。

Colony Formation assay

肿瘤 细胞接种活率检测 实验技术
概述  :  

克隆形成是常见的细胞实验技术,是检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。该方法一般包括平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大,正常细胞克隆形成率较弱,而肿瘤细胞则较强;初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强。原理克隆形成的基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为克隆或是集落。每个克隆含有50个以上的细胞,大小在0.3-1.0 mm之间。克隆或是集落

Colony   英  ['kɒlənɪ]   美  ['kɑləni]

       n. 殖民地;移民队

同根词   adj. colonial 殖民地的,殖民的

       This colony was captured by the British in 17th century.  这个殖民地是在17世纪被英国人占领的。

 

Formation   英  [fɔː'meɪʃ(ə)n]   美  [fɔr'meʃən]

       n. 形成;构造;编队

       What is its formation mechanism?  它的形成机制是什么?

 

assay   英  [ə'seɪ; 'æseɪ]   美  [ə'se]

       n. 化验;试验

               vt. 分析;化验;尝试

               vi. 鉴定;经检验证明内含成分

同根词   n.assayer 试金者,尝试者;分析专家

      Each assay index all becomes normal.  各项化验指标恢复正常。

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