Immunoprecipitation   /'imjunəupri,sipi'teiʃən/

释    义   n. 免疫沉淀反应

例    句   The tyrosine phosphorylation of NR2B was analyzed by immunoprecipitation and immunoblot assay.  NR2B酪氨酸磷酸化通过免疫沉淀和免疫印渍分析。

概述

经典的免疫沉淀是可溶性抗原与其抗体产生可见沉淀反应的血清学实验。经发展后，现在免疫沉淀是指利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法，抗原抗体结合后，用固相的蛋白A或者蛋白G（protein A/G）吸附分离抗原抗体复合物，达到分离或微量检测抗原的目的。该方法是研究两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可以用于确定与特定蛋白质存在相互作用的其他蛋白，已经成为研究蛋白质相互作用的经典方法。

原理

免疫沉淀一般指采用固定在固相支持物上的结合蛋白，进行小规模的蛋白质亲和纯化的实验。其基本原理是抗原蛋白质能与其对应抗体特异性结合，同时利用细菌蛋白质protein A/G能够特异性地结合到抗体的FC片段。通常采用结合有protein A/G的琼脂糖珠（argarose beads）与含有抗原的溶液以及抗体反应后，将目的抗原吸附到结合protein A/G的argarose beads，当抗原、抗体以及argarose beads结合后，充分洗涤后采用适当的洗脱缓冲液等将抗原从argarose beads复合物中洗脱出目的抗原，最终达到从成分复杂的总蛋白裂解液中分离出所需的特定目的抗原。

由于argarose beads存在一定的缺陷，很多公司对该技术进行了改进，目前用于免疫沉淀技术的试剂大多提供的是结合有protein A/G的磁性微粒，磁性微粒是球形固体，抗体结合仅限于每个磁珠的表明。虽然磁珠不具有多孔中心以增加结合能力的优势，但它们明显小于琼脂糖微珠（直径1-4 um），可提供足够大的总表面积以满足高容量的抗体结合。

另外，常常会与免疫沉淀（IP）技术同时出现的免疫共沉淀（Co-IP）技术，其基本原理和技术操作都与IP十分类似，都是利用抗原和抗体之间的这种特异性结合，但IP的实验目的是纯化单一目的抗原。免疫共沉淀目的则是分离与目的抗原存在相互作用的蛋白质复合物。Co-IP主要用于研究蛋白质之间的相互作用的经典方法，细胞在非变形条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来，因此通过Co-IP分离目的蛋白的同时能够获得与其存在相互作用的所有蛋白复合物。

实验方法

IP实验的大致实验流程如下：

1、 收集细胞，采用直接收集离心（悬浮细胞）或是胰酶消化（贴壁细胞）收集细胞悬液，用预冷的PBS洗涤细胞2次；

2、 加入IP裂解液，根据细胞数量加入适量的IP裂解液，IP裂解液在使用时加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果的则应该在IP裂解液中同时加入磷酸酶抑制剂，酶抑制剂均需要现配现用；该过程均在冰上操作；

3、 将细胞放置于冰上裂解30min，如果细胞溶解不完全，可在冰上短时超声裂解1-2min；

4、 根据实验需求取适量的已准备好的样本裂解液到EP管中，加入相应抗体，需要设置阴性对照（未加入抗体的Input组）以及同种属来源的一抗IgG对照组，4℃旋转过夜，使抗体与样本中待分离的抗原充分孵育；

5、 取适量的洗涤好的protein A/G-beads(根据抗体的亚型选择protein A或G，一般用量在50 ul每个样品)，加入到抗原-抗体孵育的EP管中，4℃旋转4h；

6、 免疫沉淀反应过后，4℃离心，弃去上清，用洗涤缓冲液洗涤抗原-抗体-protein A/G-beads沉淀3-4次，最后一次洗涤留30-50 ul缓冲液（根据实验设计）；

7、 加入蛋白加样缓冲液，沸水煮8-15min；

8、 4℃高速离心10min，将离心后的上清转移到新的EP管中，此为免疫沉淀后获得的目的抗原蛋白溶液，之后可上样进行SDS-PAGE以及Western blot分析和检测目的抗原。

IP实验较为关键的在于样品的前期处理，以及IP裂解液的选择和配置。蛋白裂解液中的去垢剂可以裂解细胞质膜，也同时破坏了许多细胞器的膜，从而释放了其中储存的许多蛋白酶。而由于用于IP实验的去垢剂作用较为温和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。还有一部分蛋白酶来自细胞质中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制环境受到改变后从而恢复了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶，通过protease cocktail（多种蛋白酶抑制剂混合物）可以抑制蛋白酶。