摘要

Allele-specific polymerase chain reaction (PCR) (amplification-refractory mutation system, ARMS) is one of the most commonly used methods for mutation detection. However, a main limitation of ARMS-PCR is the false positive results obtained due to nonspecific priming that can take place with wild-type (WT) DNA, which often precludes detection of low-level mutations.  To improve the analytical specificity of ARMS, we present here a new technology, NAPA: NaME-PrO-assisted ARMS, that overcomes the ARMS deficiency by adding a brief enzymatic step that reduces wild-type alleles just prior to ARMS. We performed this technology for the simultaneous detection of two hot-spot PIK3CA mutations (E545 K and H1047R) in circulating tumor cells (CTCs) and cell free DNA (cfDNA).  The developed protocol could simultaneously detect mutation-allelic-frequency of 0.5% for PIK3CA exon 9 (E545 K) and 0.1% for PIK3CA exon 20 (H1047R) with high specificity. We further compared the developed NAPA assay with (a) ddPCR considered as the gold standard and (b) our previous assay based on the combination of allele-specific, asymmetric rapid PCR, and melting analysis. Our data show that the newly developed NAPA assay gives consistent results with both these assays (p = 0.001).

译文

等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)是目前最常用的突变检测方法之一。然而,ARMS-PCR的一个主要局限性是由于野生型(WT)DNA可能发生非特异性启动而获得的假阳性结果,这通常排除了检测低水平突变的可能性。为了提高ARMS的分析特异性,我们在这里提出了一种新技术NAPA:NaME-PrO-assisted ARMS,它通过在ARMS之前添加一个减少野生型等位基因的酶步骤来克服ARMS缺陷。我们利用这项技术同时检测了循环肿瘤细胞(ctc)和无细胞DNA(cfDNA)中的两个热点PIK3CA突变(E545 K和H1047R)。该方法能同时检测PIK3CA外显子9(E545 K)和PIK3CA外显子20(H1047R)突变等位基因频率,特异性高,分别为0.5%和0.1%。我们进一步比较了NAPA法和(a)ddPCR作为金标准,以及(b)我们以前的基于等位基因特异性、不对称快速PCR和熔融分析的方法。我们的数据表明,新开发的NAPA分析结果与这两种分析结果一致(p=0.001)。

amplification refractory mutation system

肿瘤 体外扩增 实验技术
概述  :  

聚合酶链式反应是一项体外扩增技术,由于灵敏度高、特异性强等优势,其应用已给整个核酸研究领域带来了一场革命。结合PCR技术所进行的限制性片段长度多态性分析法已成为检测DNA分子碱基变化的常用方法。但是,能检测点突变的方法仍主要依赖于RNase错配切割分析、特异性等位基因寡核苷酸探针杂交等技术,它们需特殊性标记(放射性标记等)或昂贵的仪器,技术要求高,操作繁杂。 为克服这些不足,1989年由科学家在PCR的基础上,建立了扩增阻滞突变系统(ARMS)。在一定条件下PCR引物3’末端的错配

Amplification   英 /ˌæmplɪfɪˈkeɪʃn/   美 /ˌæmplɪfɪˈkeɪʃn/

释    义   n. [电子] 放大(率);扩大;详述

同根词   amplifier n. [电子] 放大器,扩大器;扩音器

               amplify vi. 详述

               amplify vt. 放大,扩大;增强;详述

例    句   And the power amplifier can realize accurately tracking and amplification for AC signals with frequency range up to 1000Hz. 功率放大器可以实现交流信号的准确跟踪和放大,输出频率范围可达1000赫兹。

 

Refractory   英 /rɪˈfræktəri/   美 /rɪˈfræktəri/

释    义   adj. 难治的;难熔的;不听话的

               n. 倔强的人;耐火物质

同根词   refractoriness n. 耐火性;耐熔性;不应性

例    句   The question is, how is some of this converted into refractory compounds? 但问题是,部分溶解有机物是如何转化成难熔化合物的。

 

Mutation   英 /mjuːˈteɪʃn/   美 /mjuːˈteɪʃ(ə)n/

释    义   n. 突变;变化;元音变化

同根词   mutant adj. 突变的

               mutagenic adj. 诱变的;致突变的

               mutational adj.突变的

               mutative adj. 变化的;生物突变的

               mutant n. 突变体;突变异种

               mutability n. 易变性;性情不定;突变性

               mutagen n. 诱导有机体突变的物质

               mutagenesis n. 突变形成;变异发生

               mutate vi. 变化,产生突变

               mutate vt. 改变,使突变

例    句   It is to be investigated whether this mutation is associated with virulence. 此变异是否与病毒的毒力有关尚待进一步研究。


System   英 /ˈsɪstəm/   美 /ˈsɪstəm/

释    义   n. 制度,体制;系统;方法

例    句   They have a support system of these all around from one base to another. 他们有一个支持系统,这些都从一个基站周围到另一个。

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