Annexin V-FITC/PI

释    义   n. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒

例    句   To evaluate the merits and demerits of annexin V-FITC/PI and Hoechst33342/PI double stainings in the detection of apoptosis by flow cytometry.评价annexin V-FITC/PI和Hoechst33342/PI双染色法在流式细胞术检测细胞凋亡中的优缺点。

概述

该试剂盒主要用于检查肾内泌尿方向的细胞系凋亡方面的研究，比如肾癌细胞系、前列腺癌细胞系等。主要的原理是在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。另外，碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。FITC最大吸收波长为490nm，激发波长为525nm，PI-DNA复合物的最大吸收和发射波长分别为535nm和615nm。

操作步骤

（1）样品染色：将Binding Buffer（10×）稀释成1×Binding buffer工作液备用（1ml Binding Buffer（10×）需加入9ml无菌去离子水）。对于悬浮细胞，500-1000g离心5min收集细胞。对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短，最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，加入细胞培养液，将细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，500-1000g离心5min收集细胞。收集细胞后，加入预冷PBS溶液轻摇或用移液器轻柔吹打洗涤，离心收集细胞，共洗涤两次。在细胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重悬细胞，使细胞浓度达到1×10⁶ cell/ml。吸取100μl细胞悬液（细胞总数为1×10⁵ cell）置一新管中，加入5μl Annexin V-FITC和5-10 μl PI，轻轻混匀，室温避光孵育15min。

（2）样品检测：流式细胞仪检测：建议设置正常细胞、PI单染和Annexin V-FITC单染3个对照组，正常细胞组可作为荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。若十字门的位置不易设定，可采用经凋亡诱导的细胞进行设定。结果可用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），FITC为横坐标，PI为纵坐标。Annexin V-FITC和PI联合使用时，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色双重荧光。荧光显微镜检测：染色孵育后涂片，显微镜下观察。使用荧光显微镜上的蓝光和绿光通道分别观察FITC和PI。被Annexin V-FITC结合的细胞显示浆膜上有绿色光环。丧失细胞膜完整性的细胞，细胞核显示红色，膜上有绿色光环。

注意事项

（1）可立式离心管内试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。（2）Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）是光敏物质，在保存与操作时请注意避光。（3）在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留影响实验结果。（4）为获得准确试验结果，建议样品在Annexin V-FITC染色后1小时内进行分析。