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Next generation sequencing

肾内泌尿

关键词肾内泌尿 诊断方式 基础研究

词汇介绍

拓展阅读

解析

Next   英 /nekst/   美/nɛkst/

释    义   adj. 紧接在后的;贴近的;其次的

               adv. 然后;下次;其次

               n. 下一个人或事件

               prep. 靠近;居于…之后

               det. 下次;紧接在后的;另一个

例    句   What do you think I should do next?  你认为我下一步该怎么办呢?

 

Generation   英 /dʒenə'reɪʃ(ə)n/   美/'dʒɛnə'reʃən/

释    义   n. 一代;产生;一代人;生殖

同根词   generative adj. 生殖的;生产的;有生殖力的;有生产力的

               generational adj. 一代的;生育的

               generator n. 发电机;发生器;生产者

               generate vt. 使形成;发生;生殖

例    句   I weep for our generation!  我为我们这一代哀悼!

 

Sequencing   英 /'siːkwənsɪŋ/   美/'sikwənsɪŋ/

释    义   n. [计] 排序;[计] 定序;排列程序

               v. [计] 定序(sequence的ing形式);使按顺序排列

例    句   In this paper, comparison of the sequencing comparison, hoping to find a suitable algorithm.  本文主要对比各排序进行对比,希望能找出一种合适的算法。

概述

概述


NGS测序技术,是指不基于sanger的高通量DNA测序技术。可以同时对数以百万计或数十亿计的DNA链进行测序,从而大大提高通量。相对于传统的一代测序(sanger测序)来说,二代测序的优点是通量高,缺点是读长短,目前主流的Illumina公司的测序平台常用的读长模式是150PE或者100PE

 

原理


二代测序从最开始发展时先后出现了罗氏454平台、Illumina HiSeq系列平台以及ABI公司的Solid平台,测序原理分为合成法测序以及链接法测序。随着技术的不断发展,目前只有Illumina系列平台成为主流平台,该公司的所有平台测序原理是边合成边测序的原理,通过不同颜色荧光标记4dNTP,当对模板链的互补链进行合成时,合成一个碱基就释放出不同的荧光。根据捕捉的荧光信号并经过计算机软件处理,就可以获得待测定DNA的序列。这里以HiSeq系列平台进行整个流程介绍。


样本制备及质控:将DNARNA从组织或者血液样本中抽提出来,并通过Qubit、安捷伦2100等进行定量以及质量测定。未降解且浓度达到一定要求的样本可以进行后续文库构建工作。


文库构建:首先通过机械法、酶切法等将DNA样本按照一定大小要求随机化进行打断,这个根据所需要构建的文库大小来确定。然后在这些片段化的序列两端加上接头(Adaptor)。如果是RNA样本,则需要先反转录成cDNA,再加上接头,最终文库构建完成,通过安捷伦2100进行文库质控。


上机测序:HiSeq系列的测序反应是在flow cell里进行的,每一个flow cell被分成8lane,每个lane的内表面有很多被固定的单链接头。将上述文库构建后带接头的DNA片段变性成单链,并与lane内部接头引物结合成桥状结构,通过桥式PCR进行预扩增。预扩增的结果是在flow cell表面获得了很多条成簇分别的双链待测片段。然后加入荧光标记的dNTPDNA聚合酶等进行扩增。每增加一个碱基就会释放出相对应的荧光,测序仪捕捉这些荧光并通过计算机将光信号进行转化,从而得到序列信息。


数据分析:测序完成一般我们叫下机,下机的数据格式最终转化成Fastq文件,包含序列信息、碱基的质量值等。这样就可以知道待测序列的信息了。后续根据不同的项目可以进行不同的分析,比如进行人全基因组重测序的项目,则需要将测序的reads比对人的参考基因组上,寻找SNP等变异信息;如果是对未知基因组序列的物种进行测序,则需要通过基因组组装软件对这些reads进行组装,最终拿到该物种的组装基因组序列信息。

 

应用


NGS目前广泛应用于疾病研究、药物筛选、癌症早筛以及其他物种的基因组数据挖掘、新物种的基因组信息解析等,同时,NGS技术的出现也加速了宏观环境中微生物种类的研究,16SrRNA多样性分析、宏基因组、宏转录组研究等都更容易揭示环境中微生物的种类、丰度等信息。目前肠道微生物与癌症等疾病的关系也备受重视,也是目前研究的热点。


NGS在临床上的应用


(1)已知疾病靶点,比如肺癌靶向用药检测等,这一类疾病的致病基因以及位点明确,可以使用现成、成熟的靶向基因组测序,通过检测靶向位点获得变异信息,从而协助临床医生指导用药或者解决问题等。


(2)未知位点的疾病病因挖掘,这一类在单基因遗传病中应用比较多,主要的解决途径是进行全外显子测序,甚至有的需要进行全基因组测序。比如患者家庭中突然出现一例比较特殊的疾病患者,通过前期的文献、数据库等无法找到合适的致病位点或者病因。这是可以通过外显子测序结合临床症状进行数据挖掘,寻找出可能的致病变异并在后续进行验证。


(3)NGS技术与液体活检技术相结合也是目前正在流程的思路,由于cfDNA在血液中的含量比较低,通过NGS可以一次性获得大量的数据信息,相对于PCR或者其他技术可以获得更多的信息。

 

问题与展望


目前NGS在肿瘤靶向用药方面的应用已经比较成熟,几乎所有的肿瘤患者尤其是肺癌患者都会进行靶向基因测序,以确定是否有合适的靶药使用。随着技术的发展,通过血液中ctDNA进行靶药检测也日趋成熟,血液取样解决了组织样本无法反复获得的麻烦,而且肿瘤患者体内ctDNA的含量高,所以需要的检测技术灵敏度相对要求低。同时,随着二代测序技术的不断发展,也加速了新药的研发,通过二代测序可以直接获得疾病的相关位点,直接对这些位点进行药物设计,加速了药物发展的进程。相信这一技术后续会越来越成熟,而且会有更多人受益。


但是NGS也存在一些问题,比如读长短,无法直接检测一些大的结构变异;在肿瘤早筛领域的应用时灵敏度不够,技术和专业要求高,如果不实现自动化,一般的医院和医生将无法实现自主操作,只能依靠第三方等。另外,目前中国包括全世界都缺乏行业标准来约束和规范NGS,所以导致各家公司的测序数据质量层次不齐,可能会严重影响临床医生对疾病的判断。


最后,NGS于我们是一把双刃剑,如何合理并且有效的利用是我们必须要考虑的。相信随着时间的推移,会有不断完善的行业法规出现,NGS也会为临床带来更大的变革。

 

衍生知识


基因组学(genomics)的概念最早于1986年由美国科学家Thomas Roderick提出,指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱)、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。基因组学研究主要包括以全基因组测序为目标的结构基因组学以基因功能鉴定为目标的功能基因组学两方面的内容。


外显子组测序(exome sequencing)也称目标外显子测序,是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。是一种选择基因组的编码序列的高效策略,外显子测序相对于基因组重测序成本较低,对研究已知基因的SNPIndel等具有较大的优势。

Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology复制标题

基因组学驱动的肿瘤学中液体活检的当前和未来展望

发表时间:2018-11-08

影响指数:43.7

作者: Ellen Heitzer

期刊:Nat Rev Genet

The key objective of precision oncology is to improve diagnosis and treatment of cancer. To this end, a variety of genomic and other molecular analyses can be applied to tumour material to help identify known predictive markers to guide the selection of treatment, derive a molecular subtype classification that might enable estimation of the prognosis, characterize somatic alterations involved in tumour progression, detect disrupted pathways and identify molecular discriminants of metastatic disease. Although a range of  next-generation sequencing (NGS)-based approaches have been used to characterize tumour genomes in detail, a more accurate classification of tumour types can be achieved through comprehensive, multiparameter analyses. For example,  The Cancer Genome Atlas (TCGA) research network generated comprehensive molecular profiles at the DNA, RNA, protein and epigenetic levels for hundreds of tumours.

译文

精确肿瘤学的关键目标是改善癌症的诊断和治疗。 为此,可以将多种基因组和其他分子分析应用于肿瘤材料,以帮助鉴定已知的预测标记物以指导治疗的选择,推导出可以估计预后的分子亚型分类,表征肿瘤中涉及的体细胞改变。 进展,检测破坏的途径并确定转移性疾病的分子判别。 尽管已经使用一系列基于下一代测序(NGS)的方法来详细表征肿瘤基因组,但是通过全面的多参数分析可以实现更准确的肿瘤类型分类。 例如,癌症基因组图谱(TCGA)研究网络在数百种肿瘤的DNA,RNA,蛋白质和表观遗传水平上产生了全面的分子谱。

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