心血管
词汇介绍
拓展阅读
解析
single /ˈsɪŋɡl/
释 义 adj. 单一的;单身的;单程的
同根词 singly adv 逐一地;个别地;各自地;直截了当地
singleness n 单一;独身;真诚;专心
singularize vt 使显著;使单一化;使成为唯一;使成为单数
例 句 The graduate student ploughed through hundreds of pages of material to unearth a single fact. 为了找一个简单的事实,这位硕士研究生费力地查阅了数百页的资料。
sequencing /ˈsiːkwənsɪŋ/
释 义 n. [计] 排序;[计] 定序;排列程序
同根词 sequential adj 连续的;相继的;有顺序的
Sequent adj 连续的;其次的;作为结果而产生的
Sequent n 结果;相继发生的事
Sequencer n 程序装置,[计] 定序器
例 句 If the ordering of messages is important to your application, you need to add sequencing data to each message. 如果消息的次序对于您的应用程序很重要,就需要在每个消息中添加序列数据。
概述
实验原理
单细胞测序技术是一项能够在单个细胞的水平上,对基因组进行高通量测序分析的技术。该技术不仅能够用于分析相同性状细胞的遗传异质性,还能用于获取难以培养微生物的遗传信息。目前,单细胞测序技术已经初步应用到了海洋微生物多样性以及癌症患者体细胞突变多样性的研究中。我国在单细胞测序领域处于国际领先水平,深圳华大基因率先建立了单细胞外显子组测序技术,应用于骨髓增殖性肿瘤和肾透明细胞癌的研究中,在单个细胞的水平上解析了瘤内细胞遗传异质性,为癌症的发生发展机制及诊断治疗开辟了新方向,并为其他类型肿瘤的研究提供了新思路。单细胞测序技术的流程主要包括单细胞分离、细胞溶解与基因组DNA获取、全基因组扩增、测序与数据分析4方面。
实验步骤
1.单细胞分离:要对单个细胞进行研究,首先要将目的细胞从生长环境中分离出来,并确保其生物完整性。目前常用的单细胞分离方法有连续稀释法、显微操作法、激光捕获显微切割术(1aser capture microdissection,LCM)、拉曼镊子技术(Raman tweezers)、荧光激活细胞分选术(流式细胞分选术) (fluorescence activated cell sorting,FACS) 和微流控技术(microfluidics)等。另外微流控技术为单细胞研究开辟了新道路。该技术是利用微米级尺度上流体惯性可以忽略这一原理,通过人为控制流体流动来进行细胞分离的。微流控装置具有1个多通道结构,通道直径在10~100μm之间,相当于1个单细胞的大小。另外通道直径可以灵活调节,通道本身也可以进行多种功能性修饰(如捕获分子、抗体、电极等)。
2.细胞溶解与基因组DNA获取:分离得到单细胞后,需要将细胞进行溶解来获取基因组DNA(genome DNA,gDNA)。这一步骤非常关键,gDNA的质量直接影响后续基因组扩增的效果。目前细胞溶解的法可以分为3大类:物理法(如超声、冷冻、研磨、剪切、高压和热破坏法)、化学法(如SDS、triton X-100和极端pH)和酶降解法(如蛋白酶K和溶菌酶)。细胞溶解方法的选定,需要综合考虑多方面因素,如细胞的类型、下游用途、gDNA纯化难易程度等。
3.全基因组扩增:高通量测序至少需要200ng的DNA样品,而1个细胞中的总DNA一般仅有数皮克,即使使用第3代测序技术可能也无法满足样品量的需求,因全基因组扩增对于单细胞测序是非常必要的。目前有多种方法可以用于全基因组扩增,这些方法都是利用DNA聚合酶和不同形式的引物来进行扩增的,包括特异性的、简并的或杂合的引物。而扩增手段包括基于PCR(Polymerase Chain Reaction, 聚合酶链式反应)、MDA(multiple displacement amplification,多位点置换扩增),或两者相结合。
4.基因组测序及数据分析:成熟的第2代测序平台和快速发展的第3代测序技术 已经为单细胞测序奠定了坚实的基础,因此测序费用、速度、数据量和准确率不再是制约其发展的因素。事实上,真正制约单细胞基因组测序发展的,不是文库的读取技术,而是扩增产物的质量;扩增产物分子量越大、覆盖度越均匀,可选的建库方案和测序平台就越多。
实验应用
1.在研究乳腺癌细胞演变中的作用:通过一项乳腺癌单细胞测序研究结果表明,肿瘤的演变并不是逐步的,而可能是间断性发生的。该项研究在研究肿瘤结构基因学方面提供了一种可行的方法,并且在肿瘤进化研究中是一个重大的突破,这一新型的单细胞测序在其成本降低之后,对于癌症预后及阶段确定很可能具有临床意义。但此方法的不足在于对基因组的覆盖率不高,不能用于检测在肿瘤进化过程中极其重要的单核苷酸突变。
2.在血液系统疾病中的作用:一项通过研究原发性血小板增多症的实验,建立了基于MDA的单细胞测序新方法,并全面评估了该方法的扩增均一性、灵敏度、特异度等方面,结果表明这种将多重置换扩增和测序技术相结合的单细胞测序方法既具有更高的分辨率和基因组覆盖度,又具有更好的敏感性和特异性。另外还发现了一系列可能参与肿瘤发病的基因。此项实验研究在单细胞核苷酸水平对疾病相关的基因结构进行特征性描述方面是一个重大的突破,更为重要的是确定了一种对于多种类型肿瘤均适用的单细胞测序方法,结果证明该方法在检测增殖性疾病的基因结构、克隆起源及候选癌基因方面都是极具潜力的。
3.在传染病学领域的运用:利用单细胞测序技术不仅可以检测未知的病原微生物,还可以监测到耐药株的出现,跟踪病原体的抗性,从而进行传染病的诊断。单细胞基因组学在传染病领域得到了广泛的应用,如病原体的抗性和传播跟踪,靶向或非靶向的病原基因组的恢复,致病新病原菌鉴定等。同时,利用单细胞测序技术不仅可以精细化识别微生物基因组变异,进行病原微生物进化及溯源研究,还可以在单细胞水平上研究病毒感染的动力学,定义病原微生物的代谢特征、致病潜力和耐药性,进行疾病诊断。这有助于阐明病原微生物与宿主之间的相互作用机制,会对传染病防控和人类健康领域带来重要影响。
Rare Cell Detection by Single-Cell RNA Sequencing as Guided by Single-Molecule RNA FISH复制标题
以单分子RNA FISH为指导的单细胞RNA测序稀有细胞检测
发表时间:2018-02-28
影响指数:8.6
作者: Eduardo Torre
期刊:Cell Syst
Single-cell RNA sequencing inherently subsamples the transcriptome of each cell because the probability of recovery of any individual transcript is low (typically, only 10% is recovered; Marinov et al., 2014). Moreover, the degree of subsampling is variable between cells. In principle, subsampling could have very different effects on the interpretation of expression variability from cell to cell depending on the expression level and underlying ground truth distribution. This is schematized on Figure 1A, which focuses on three genes, GAPDH, SPP1, and NGFR, and describes their actual expression and apparent expression after single-cell RNA sequencing.
译文